阿尔萨德: NuHi? eRT逆转录酶

常见问题

解释或解决方案

无cDNA产物或产量少

a.配置条件

配置Mix时在需在冰上操作

b.将过多的反转录后产物加入PCR或qPCR的Mix中

将过多的反转录产物加入PCR或qPCR的Mix中，可能会降低扩增效率。建议仅加入不超过最终PCR体积的10%的逆转录反应产物。

c.反应温度

逆转录反应条件应处于42~55°C，确保设置的温度正确且PCR仪或其他加热设备的温度准确。正常情况下建议使用42℃~50℃进行反应，在极少数情况下,当用于反应的RNA具有高度的二级结构时，可以使用55℃作为反应温度（最高不超过60℃）。但是温度越高，eRT的活性损失越快，会影响最终产物的总量。

d. 加样错误

检查是否有漏加试剂或者移液器加样体积错误等情形。按标准流程重复一次进行验证。

e.试剂的准备

所有试剂融化后进行混匀，并迅速置于冰上静置。保证所有试剂，特别是酶，处于低温状态。

f. 模板质量差或总量不足

检查RNA模板的浓度、完整性和纯度（见附件II：RNA的浓度、纯度、完整性与储存）。
在逆转录mix配置时需加入终浓度为0.5-2U/μL的RNase抑制剂（依据RNase污染程度可以做调整），确保反应中不受RNase的影响。任何微量的RNase都会导致RNA模板的降解，影响最终产物的总量及长度。

g. 模板浓度过高或过低

NuHi® eRT可用于逆转录10pg – 2.5μg的总RNA或10fg – 250ng的mRNA。
超过推荐的 RNA模板量，建议扩大反应体系。
对于过低的RNA模板，可能会产生非特异。

h.模板降解

不恰当的保存（如常温保存）或RNase污染会导致RNA模板降解。模板降解严重可能会导致产物量降低。
在进行模板预变性时，若由于变性温度过高（>65℃）或变性时间过长（>5min），也会导致RNA模板降解，从而使得产物量降低。

i. 引物量不合适或引物降解

在进行逆转录前，建议先对引物进行质检（附件III），确定引物的真实浓度和完整性。在初次使用NuHi® eRT时，建议对引物进行梯度尝试。Oligo dT引物和随机引物的终浓度建议为0.1—1.0μM，特异性引物的终浓度建议为2.5—10μM。

j. 反应时间过短

正常反应时间保持在15min-30min。若产物片段过长或具有复杂的二级结构，在温度保持在42℃-50℃时，建议适当延长反应时间。

cDNA片段过短

a.通用原因

见“无cDNA产物或产量少”的d.-j.的解决方案

b.反应温度过高

过高的反应温度会降低产物cDNA的长度。确保设置的温度正确且PCR仪或其他加热设备的温度准确。

c. 反应后逆转录酶失活步骤

对于长片段产物的逆转录，不建议在反应结束后进行逆转录酶失活处理的步骤，因为高温可能导致DNA链断裂。