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阿尔萨德比赛 www.pdedmj.com.cn NuHi® eRT逆轉錄酶 貨號:NH9011
NuHi® eRT是通過對M-MLV Reverse Transcriptase突變改造獲得的全新逆轉錄酶,具有較高的延伸性、反應效率,同時支持高溫反應。對于GC含量高或者具有二級結構的RNA模板也具有較好的兼容性。
產品規格
試劑成分
2000U
10000U
50000U
NuHi® eRT
10μL
50μL
250μL
5x NuHi® eRT Buffer
500μL
1000μL
5x 1000μL
100 mM DTT
100μL
500μL
5x 500μL
本部分針對在實驗中出現的常見問題給出可行的解決方案。如果出現其他問題或者使用推薦的解決方案無法解決,歡迎聯系我司技術支持,他們將與您進行更詳細的討論,解決出現的問題。
常見問題 |
解釋或解決方案 |
無cDNA產物或產量少 |
|
a.配置條件 |
配置Mix時在需在冰上操作 |
b.將過多的反轉錄后產物加入PCR或qPCR的Mix中 |
將過多的反轉錄產物加入PCR或qPCR的Mix中,可能會降低擴增效率。建議僅加入不超過最終PCR體積的10%的逆轉錄反應產物。 |
c.反應溫度 |
逆轉錄反應條件應處于42~55°C,確保設置的溫度正確且PCR儀或其他加熱設備的溫度準確。正常情況下建議使用42℃~50℃進行反應,在極少數情況下,當用于反應的RNA具有高度的二級結構時,可以使用55℃作為反應溫度(最高不超過60℃)。但是溫度越高,eRT的活性損失越快,會影響最終產物的總量。 |
d. 加樣錯誤 |
檢查是否有漏加試劑或者移液器加樣體積錯誤等情形。按標準流程重復一次進行驗證。 |
e.試劑的準備 |
所有試劑融化后進行混勻,并迅速置于冰上靜置。保證所有試劑,特別是酶,處于低溫狀態。 |
f. 模板質量差或總量不足 |
檢查RNA模板的濃度、完整性和純度(見附件II:RNA的濃度、純度、完整性與儲存)。 |
g. 模板濃度過高或過低 |
NuHi® eRT可用于逆轉錄10pg – 2.5μg的總RNA或10fg – 250ng的mRNA。 |
h.模板降解 |
不恰當的保存(如常溫保存)或RNase污染會導致RNA模板降解。模板降解嚴重可能會導致產物量降低。 |
i. 引物量不合適或引物降解 |
在進行逆轉錄前,建議先對引物進行質檢(附件III),確定引物的真實濃度和完整性。在初次使用NuHi® eRT時,建議對引物進行梯度嘗試。Oligo dT引物和隨機引物的終濃度建議為0.1—1.0μM,特異性引物的終濃度建議為2.5—10μM。 |
j. 反應時間過短 |
正常反應時間保持在15min-30min。若產物片段過長或具有復雜的二級結構,在溫度保持在42℃-50℃時,建議適當延長反應時間。 |
cDNA片段過短 |
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a.通用原因 |
見“無cDNA產物或產量少”的d.-j.的解決方案 |
b.反應溫度過高 |
過高的反應溫度會降低產物cDNA的長度。確保設置的溫度正確且PCR儀或其他加熱設備的溫度準確。 |
c. 反應后逆轉錄酶失活步驟 |
對于長片段產物的逆轉錄,不建議在反應結束后進行逆轉錄酶失活處理的步驟,因為高溫可能導致DNA鏈斷裂。 |