哈维阿尔萨德: NuHi? eRT逆轉錄酶

常見問題

解釋或解決方案

無cDNA產物或產量少

a.配置條件

配置Mix時在需在冰上操作

b.將過多的反轉錄后產物加入PCR或qPCR的Mix中

將過多的反轉錄產物加入PCR或qPCR的Mix中，可能會降低擴增效率。建議僅加入不超過最終PCR體積的10%的逆轉錄反應產物。

c.反應溫度

逆轉錄反應條件應處于42~55°C，確保設置的溫度正確且PCR儀或其他加熱設備的溫度準確。正常情況下建議使用42℃~50℃進行反應，在極少數情況下,當用于反應的RNA具有高度的二級結構時，可以使用55℃作為反應溫度（最高不超過60℃）。但是溫度越高，eRT的活性損失越快，會影響最終產物的總量。

d. 加樣錯誤

檢查是否有漏加試劑或者移液器加樣體積錯誤等情形。按標準流程重復一次進行驗證。

e.試劑的準備

所有試劑融化后進行混勻，并迅速置于冰上靜置。保證所有試劑，特別是酶，處于低溫狀態。

f. 模板質量差或總量不足

檢查RNA模板的濃度、完整性和純度（見附件II：RNA的濃度、純度、完整性與儲存）。
在逆轉錄mix配置時需加入終濃度為0.5-2U/μL的RNase抑制劑（依據RNase污染程度可以做調整），確保反應中不受RNase的影響。任何微量的RNase都會導致RNA模板的降解，影響最終產物的總量及長度。

g. 模板濃度過高或過低

NuHi® eRT可用于逆轉錄10pg – 2.5μg的總RNA或10fg – 250ng的mRNA。
超過推薦的 RNA模板量，建議擴大反應體系。
對于過低的RNA模板，可能會產生非特異。

h.模板降解

不恰當的保存（如常溫保存）或RNase污染會導致RNA模板降解。模板降解嚴重可能會導致產物量降低。
在進行模板預變性時，若由于變性溫度過高（>65℃）或變性時間過長（>5min），也會導致RNA模板降解，從而使得產物量降低。

i. 引物量不合適或引物降解

在進行逆轉錄前，建議先對引物進行質檢（附件III），確定引物的真實濃度和完整性。在初次使用NuHi® eRT時，建議對引物進行梯度嘗試。Oligo dT引物和隨機引物的終濃度建議為0.1—1.0μM，特異性引物的終濃度建議為2.5—10μM。

j. 反應時間過短

正常反應時間保持在15min-30min。若產物片段過長或具有復雜的二級結構，在溫度保持在42℃-50℃時，建議適當延長反應時間。

cDNA片段過短

a.通用原因

見“無cDNA產物或產量少”的d.-j.的解決方案

b.反應溫度過高

過高的反應溫度會降低產物cDNA的長度。確保設置的溫度正確且PCR儀或其他加熱設備的溫度準確。

c. 反應后逆轉錄酶失活步驟

對于長片段產物的逆轉錄，不建議在反應結束后進行逆轉錄酶失活處理的步驟，因為高溫可能導致DNA鏈斷裂。