2019亚冠杯阿尔萨德: TaqMan Master Mix

TaqMan Master MixROX free 貨號:NH9201

阿尔萨德比赛 www.pdedmj.com.cn TaqMan Master MixROX plus 貨號:NH9212

采用探針法(TaqMan,Molecular Beacon等)進行Real Time PCR的專用試劑

在進行Real Time PCR時,僅需將擴增體系稀釋至并加入相應的模板、引物及探針,即可進行實驗,簡化操作過程,縮短操作時間,降低污染。


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產品介紹

TaqMan Master Mix是采用探針法(TaqMan,Molecular Beacon等)進行Real Time PCR的專用試劑。

本制品包含:經化學修飾的Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、經優化后的緩沖液等擴增必需組分(模板、探針與引物除外)。

制品中的DNA聚合酶是經化學修飾的Hot StartDNA聚合酶,與精心研制的Real Time PCRBuffer組合使用,可以有效抑制體系中非特異性PCR擴增,大大提高PCR的擴增效率,進行高靈敏度的Real Time PCR擴增反應。

產品特點

激活時間短:激活時間降至2min,PCR凈時間65 min

特異性強:有效抑制引物二聚體

靈敏度高:低至6拷貝均可擴增

通用性強:300bp長度片段,65%GC含量均可高效擴增

信號更高:更高性噪比,擴增曲線更美觀

穩定性強:放置8Ct及特異性無變化

儲存條件及有效期

在使用前推薦-20℃保存,在使用后推薦4℃保存,避免反復凍融。

-20℃可穩定保存15個月。由于含有ROX燃料,需要避光保存。

適用儀器

TaqMan Master Mix中含有特殊的ROX參比染料,適用于所有類型的熒光定量PCR儀。

推薦反應程序


*1 在擴增高GC含量片段時,可適當增加變性時間至15-30秒。

*2退火延伸時間,可根據所擴增片段長度及熒光定量PCR儀器做調整。


Q-1. 反應無擴增曲線
a) 確認陽性對照有無擴增:每次實驗推薦附帶檢測試劑,引物/探針及模板性能的陽性對照
b) 反應循環數不夠:一般設置循環數為40-50
c) 信號采集未設置:兩部法擴增程序一般將信號采集設置在退火延伸階段;三步法擴增程序應當將信號采集設置在延伸階段
d) 引物/探針降解:長時間未用的引物應先通過PAGE電泳檢測完整性,以排除降解的可能性
e) 模板存在抑制性:所獲得模板中是否存在純化不徹底情形需排除
f) 模板濃度太低:減少稀釋度重復試驗,一般未知濃度的樣品先從最高濃度做起
g) 模板降解:重新制備模板,重復試驗
h) 操作失誤或設備故障:需排除
i) 未按照說明書條件進行實驗:在一般情況下優選說明書所提供反應條件


Q-2. 擴增曲線不正常

a) 擴增曲線不光滑:信號太弱或擴增效果過低,需提高模板濃度重復
b) 擴增曲線斷裂或下滑:模板濃度過高,減小基線終點重新分析數據或對模板進行稀釋重新檢測
c) 個別擴增曲線突然驟降:反應管內留有氣泡,擴增反應前仔細檢查反應管內是否有氣泡殘留并通過離心方法去除
d) 模板存在抑制性:所獲得模板中存在擴增抑制劑,可能導致曲線異常


Q-3. Ct值過大

a) 擴增效率低:優化反應條件,嘗試三步法擴增程序,或者重新設計引物或探針
b) 模板濃度低:減少稀釋度重復試驗,一般未知濃度的樣品先從最高濃度做起
c) 模板降解:重新制備模板,重復試驗
d) 模板存在抑制性:所獲得模板中存在擴增抑制劑,可能導致擴增失敗,提高模板稀釋倍數或者重新制備模板
e) PCR產物太長:一般將PCR產物長度設計為100 bp-150 bp之內
f) 反應條件不適合:優化退火溫度及延伸時間


Q-4. SNP分型點分布不理想

a) 擴增效率低:優化反應條件,嘗試三步法擴增程序,或者重新設計引物探針
b) 模板濃度低:減少稀釋度重復試驗,一般未知濃度的樣品先從最高濃度做起
c) 模板降解:重新制備模板,重復試驗
d) 模板存在抑制性:所獲得模板中存在擴增抑制劑,可能導致擴增較差,信號較低,提高模板稀釋倍
e) 探針設計不理想:探針識別能力有限,建議重新設計探針


Q-5. 陰性對照NTC有擴增

a) 反應試劑被污染:更換新批次試劑并在有條件情況下更換實驗場地重復試驗
b) SG Mix中可能出現引物二聚體擴增:查看溶解曲線并與目的產物溶解曲線對比,如若為二聚體產物且Ct>36可忽略
Q-6. 標準曲線線性關系不理想
a) 加樣誤差:加大模板稀釋倍數,提高加樣體積,減少加樣誤差
b) 標準品稀釋不準確:重新稀釋標準品并重復實驗
c) 擴增效率差:引物擴增效率較差,可優化反應條件或重新設計引物
d) 標準品降解:重新制備標準品,重復試驗
e) 標準品使用濃度過高:適當降低標準品使用濃度,重復實驗


Q-7. SG溶解曲線多峰

a) 引物設計非特異:根據設計原則設計新的引物
b) 反應條件不適合:優化退火溫度,增加反應特異性
c) 引物濃度太高:適當降低引物濃度
d) 模板濃度低:減少稀釋度重復試驗,高濃度模板下會使特異性變強


Q-8. 實驗重復性差

a) 儀器狀態不佳:定期校準儀器
b) PCR板材或貼膜均一性差:更換優質供應商
c) 模板濃度低:減少稀釋度重復試驗,高濃度模板下會使擴增重復性加強
d) 加樣體積存在較大偏差:使用電動連續分液器并仔細操作,同時增大試劑操作體積
e) 試劑混勻不佳:混合試劑要充分混勻并離心后使用


Q-9. 產品穩定性如何

a) 產品-20℃保存有效期1年,4℃保存有效期1個月
b) 反復凍融次數不得超過8次